Y迷宮訓(xùn)練對成年大鼠海馬齒狀回細胞的增殖作用

摘要:目的　觀察Y迷宮訓(xùn)練對成年大鼠海馬齒狀回(dentate gyrus ,DG) 神經(jīng)干細胞/ 前體細胞的增殖作用。

方法　通過Y迷宮訓(xùn)練,用52溴222脫氧尿嘧啶核苷(52bromo222deoxyuridine ,BrdU) 標記增殖細胞,用ABC **細

胞化學(xué)方法觀察成年大鼠海馬齒狀回細胞的增殖情況。結(jié)果　Y迷宮訓(xùn)練組海馬齒狀回BrdU 陽性細胞數(shù)明顯多

于對照組( P < 0. 05) ,且Y迷宮訓(xùn)練成績的優(yōu)劣與海馬齒狀回神經(jīng)細胞增殖的多少存在相關(guān)性,學(xué)習(xí)成績良好組

齒狀回BrdU 陽性細胞數(shù)顯著多于學(xué)習(xí)成績低劣組( P < 0. 05) 。結(jié)論　Y迷宮訓(xùn)練可促進成年大鼠海馬齒狀回神

經(jīng)干細胞/ 前體細胞的增殖。

關(guān)鍵詞: Y迷宮; 學(xué)習(xí); 海馬; 細胞增殖

　　近年的研究[1 ,2 ]表明:成年哺乳動物海馬終生

存在神經(jīng)發(fā)生(neurogenesis) ,其**區(qū)位于海馬齒

狀回的顆粒下層( subgranular layer , SGL) 。成年海

馬神經(jīng)的發(fā)生受多種因素的調(diào)節(jié),包括生理因素和

病理因素。促進神經(jīng)發(fā)生的因素有豐富多彩的環(huán)

境、運動、癲癇等;抑制神經(jīng)發(fā)生的有應(yīng)激、衰老及5

- 羥色胺缺失等[3 ,4 ] 。學(xué)習(xí)記憶也能促進海馬神經(jīng)

發(fā)生。Gould 等[5 ]報道經(jīng)典的條件反射及Morris 水

迷宮學(xué)習(xí)能促進海馬齒狀回新生神經(jīng)元的存活。

Lemaire 等[6 ] 的研究表明,Morris 水迷宮學(xué)習(xí)能促進海馬齒狀回神經(jīng)干細胞/ 前體細胞的增殖。目前

國內(nèi)外有關(guān)學(xué)習(xí)記憶對海馬神經(jīng)發(fā)生的研究大多使

用Morris 水迷宮模型[1 ,5 ,6 ] ,用Y 迷宮模型的還未

見報道。因此,本研究探討Y迷宮訓(xùn)練對海馬神經(jīng)

發(fā)生的作用?，F(xiàn)報道如下。

1 　材料和方法

1. 1 　材料

1. 1. 1 　實驗動物和分組　成年雄性SD 大鼠18

只,體重180～220 g ,蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供。將動物隨機分成對照組(動物置于Y迷宮內(nèi)

自由活動,不施以電擊和燈光指示,放置的時間和輪

次同訓(xùn)練組, n = 6) 和Y 迷宮訓(xùn)練組(每日訓(xùn)練3

輪,時間點為9∶00 、12∶00 、15∶00 ,每輪訓(xùn)練20 次,

連續(xù)3 d , n = 12) 。

1. 1. 2 　實驗試劑　BrdU ,美國Roche 公司;BrdU

單克隆抗體, 美國Biosource 公司; 羊抗鼠二抗及

ABC(avidin2biotin complex ,ABC) 試劑盒,Vector 公

司;DAB 顯色劑,美國Sigma 公司。

1. 2 　方法

1. 2. 1 　BrdU 標記　于**輪和第三輪Y 迷宮訓(xùn)

練前1 h ,取BrdU 50mg/ kg , 溶于生理鹽水,腹腔注

射2 次/ d ,間隔6 h ,連續(xù)3 d。第4 d 處死動物。

1. 2. 2 　學(xué)習(xí)記憶訓(xùn)練　Y 迷宮由3 個相同的臂組

成,分別稱為Ⅰ區(qū)、Ⅱ區(qū)、Ⅲ區(qū)。通常把下臂( Ⅰ臂)定為起步區(qū),左側(cè)( Ⅱ臂) 為**區(qū),右側(cè)( Ⅲ臂) 為電

擊區(qū),三臂相交處為隔離區(qū)(0 區(qū)) 。迷宮底鋪以銅

棒,可以通電刺激。三臂頂端各裝有15W 的信號

燈。實驗前先將大鼠放入迷宮,讓其適應(yīng)5 min ,訓(xùn)

練組大鼠在起步區(qū)予以電擊致其逃至**區(qū),燈光

持續(xù)15 s ,然后熄燈休息45 s ,開始下一次操作。每

次實驗在每只大鼠上重復(fù)20 次為一輪。實驗在黑

暗、安靜的環(huán)境中進行。凡大鼠受電擊后10 s 內(nèi)一

次性從起步區(qū)逃至**區(qū)的反應(yīng)稱為“正確反應(yīng)”,

否則為“錯誤反應(yīng)”。以連續(xù)10 次電擊中正確反應(yīng)

達9 次或以上定為學(xué)會標準。達到學(xué)會標準所需的

電擊次數(shù)表示學(xué)習(xí)記憶成績,電擊次數(shù)少說明學(xué)習(xí)

能力強。

1. 2. 3 　**組織化學(xué)檢測　大鼠經(jīng)4 %的水合氯

醛麻醉,開胸,左心室插管至主動脈,先快速灌流

0. 01mol/ L 的磷酸鹽緩沖液( phosphate buffered

saline , PBS) , 再用4 %的多聚甲醛(paraformalde2

hyde , PFA) 緩慢灌流。取腦置于4 %的PFA 中固

定8 h 后,再轉(zhuǎn)入20 %的蔗糖中過夜,從前囟后3. 3

～5. 1 mm 作連續(xù)冰凍切片,片厚30 μm ,隔2 張取

1 張。**組織化學(xué)ABC 法的步驟詳見本實驗室

以往的研究[7 ] ,簡要步驟如下:腦片于4 mol/ L 的鹽酸中室溫下孵育30 min ;0. 1 %的胰酶37 ℃孵育10

min ;小鼠單克隆抗體BrdU 一抗室溫下過夜( 1 ∶

200 ,Biosource) ;羊抗鼠二抗室溫下孵育2 h (A/ B∶

200 ,Vector) ;DAB 顯色5 min。各步驟間用0. 01

mol/ L 的PBS 漂洗3 次,每次5 min。常規(guī)封片,在

光鏡下觀察**反應(yīng)陽性細胞,并計數(shù)和作顯微攝

影。

1. 2. 4 　統(tǒng)計方法　每只大鼠隨機選取4～5 張腦

片,光學(xué)顯微鏡下( ×400 倍) 計數(shù)每張腦片雙側(cè)海

馬齒狀回顆粒細胞層(granular cell layer , GCL) 、顆

粒下層及門區(qū)的BrdU 陽性細胞數(shù)。取每只大鼠4

～5 張腦片BrdU 陽性細胞的均數(shù)作為統(tǒng)計數(shù)據(jù),以

均數(shù)±標準差( .x ±s) 表示,并用SPSS10. 0 軟件作

方差分析,Excel 作數(shù)據(jù)處理并制成統(tǒng)計圖。

2 　結(jié)果

2. 1 　學(xué)習(xí)記憶訓(xùn)練結(jié)果　12 只成年大鼠經(jīng)過3 d

的Y迷宮學(xué)習(xí)訓(xùn)練后,所有大鼠均達到學(xué)會標準。

2. 2 　**組化檢測結(jié)果　對照組成年大鼠海馬齒

狀回可見少量的BrdU 陽性細胞,分布在齒狀回顆

粒細胞層、顆粒下層及門區(qū),且大多位于海馬齒狀回

顆粒下層。BrdU 陽性細胞常聚集成叢,細胞核較

小,形態(tài)不一,呈圓形、橢圓形或無規(guī)則型(圖1a) ;

海馬齒狀回BrdU 陽性細胞數(shù)為39. 37 ±2. 32 。訓(xùn)

練組大鼠海馬齒狀回的BrdU 陽性細胞亦分布在顆

粒細胞層、顆粒下層及門區(qū),其中以顆粒下層增多*

明顯(圖1b、圖1c) ;BrdU 陽性細胞數(shù)為57. 43 ±

11. 29 。兩組的BrdU 陽性細胞數(shù)比較,有顯著性差

異( P < 0. 05) 。

2. 3 　Y迷宮訓(xùn)練成績優(yōu)劣與海馬齒狀回細胞增殖

的關(guān)系　12 只成年大鼠進行Y迷宮訓(xùn)練后,達到學(xué)

會標準時電擊次數(shù)的均數(shù)為40. 75 。學(xué)習(xí)記憶能力

優(yōu)劣的判定,以每只大鼠達到學(xué)會標準時的電擊次

數(shù)為依據(jù)。低于40. 75 ,列為學(xué)習(xí)成績良好組( n =

6) ;高于40. 75 ,列為學(xué)習(xí)成績低劣組( n = 6) 。**

組織化學(xué)結(jié)果顯示,學(xué)習(xí)成績良好組齒狀回BrdU

陽性細胞數(shù)(65. 48 ±10. 51) 多于成績低劣組(49. 38

±3. 49) ( P < 0. 05 ,如圖2) 。再將每只大鼠Y迷宮

訓(xùn)練達到學(xué)會標準時的電擊次數(shù)和齒狀回BrdU 陽

性細胞數(shù)之間作相關(guān)分析,發(fā)現(xiàn)兩者之間呈明顯負

相關(guān)( r = - 0. 91 ,圖3) 。說明齒狀回BrdU 陽性細

胞數(shù)的增加與Y迷宮訓(xùn)練的成績密切相關(guān),訓(xùn)練成

績越好,海馬齒狀回細胞增殖越多。

3 　討論

海馬與學(xué)習(xí)記憶密切相關(guān)。Y迷宮用于檢測大

鼠空間辨別的學(xué)習(xí)記憶能力,大鼠在迷宮中對電刺

激出現(xiàn)被動逃避反應(yīng),經(jīng)過多次訓(xùn)練后大鼠能學(xué)會

并記住迷宮**區(qū)的空間位置。空間定位的記憶障

礙只有在海馬或海馬周圍區(qū)域受到損傷的情況下才

會出現(xiàn)。摘除雙側(cè)海馬出現(xiàn)空間學(xué)習(xí)、記憶障礙,可1. 2. 4 　統(tǒng)計方法　每只大鼠隨機選取4～5 張腦

片,光學(xué)顯微鏡下( ×400 倍) 計數(shù)每張腦片雙側(cè)海

馬齒狀回顆粒細胞層(granular cell layer , GCL) 、顆

粒下層及門區(qū)的BrdU 陽性細胞數(shù)。取每只大鼠4

～5 張腦片BrdU 陽性細胞的均數(shù)作為統(tǒng)計數(shù)據(jù),以

均數(shù)±標準差( .x ±s) 表示,并用SPSS10. 0 軟件作

方差分析,Excel 作數(shù)據(jù)處理并制成統(tǒng)計圖。

2 　結(jié)果

2. 1 　學(xué)習(xí)記憶訓(xùn)練結(jié)果　12 只成年大鼠經(jīng)過3 d

的Y迷宮學(xué)習(xí)訓(xùn)練后,所有大鼠均達到學(xué)會標準。

2. 2 　**組化檢測結(jié)果　對照組成年大鼠海馬齒

狀回可見少量的BrdU 陽性細胞,分布在齒狀回顆

粒細胞層、顆粒下層及門區(qū),且大多位于海馬齒狀回

顆粒下層。BrdU 陽性細胞常聚集成叢,細胞核較

小,形態(tài)不一,呈圓形、橢圓形或無規(guī)則型(圖1a) ;

海馬齒狀回BrdU 陽性細胞數(shù)為39. 37 ±2. 32 。訓(xùn)

練組大鼠海馬齒狀回的BrdU 陽性細胞亦分布在顆

粒細胞層、顆粒下層及門區(qū),其中以顆粒下層增多*

明顯(圖1b、圖1c) ;BrdU 陽性細胞數(shù)為57. 43 ±

11. 29 。兩組的BrdU 陽性細胞數(shù)比較,有顯著性差

異( P < 0. 05) 。

2. 3 　Y迷宮訓(xùn)練成績優(yōu)劣與海馬齒狀回細胞增殖

的關(guān)系　12 只成年大鼠進行Y迷宮訓(xùn)練后,達到學(xué)

會標準時電擊次數(shù)的均數(shù)為40. 75 。學(xué)習(xí)記憶能力

優(yōu)劣的判定,以每只大鼠達到學(xué)會標準時的電擊次

數(shù)為依據(jù)。低于40. 75 ,列為學(xué)習(xí)成績良好組( n =

6) ;高于40. 75 ,列為學(xué)習(xí)成績低劣組( n = 6) 。**

組織化學(xué)結(jié)果顯示,學(xué)習(xí)成績良好組齒狀回BrdU

陽性細胞數(shù)(65. 48 ±10. 51) 多于成績低劣組(49. 38

±3. 49) ( P < 0. 05 ,如圖2) 。再將每只大鼠Y迷宮

訓(xùn)練達到學(xué)會標準時的電擊次數(shù)和齒狀回BrdU 陽

性細胞數(shù)之間作相關(guān)分析,發(fā)現(xiàn)兩者之間呈明顯負

相關(guān)( r = - 0. 91 ,圖3) 。說明齒狀回BrdU 陽性細

胞數(shù)的增加與Y迷宮訓(xùn)練的成績密切相關(guān),訓(xùn)練成

績越好,海馬齒狀回細胞增殖越多。

3 　討論

海馬與學(xué)習(xí)記憶密切相關(guān)。Y迷宮用于檢測大

鼠空間辨別的學(xué)習(xí)記憶能力,大鼠在迷宮中對電刺

激出現(xiàn)被動逃避反應(yīng),經(jīng)過多次訓(xùn)練后大鼠能學(xué)會

并記住迷宮**區(qū)的空間位置?？臻g定位的記憶障

礙只有在海馬或海馬周圍區(qū)域受到損傷的情況下才

會出現(xiàn)。摘除雙側(cè)海馬出現(xiàn)空間學(xué)習(xí)、記憶障礙,可見Y迷宮學(xué)習(xí)訓(xùn)練需要海馬的參與,是依賴海馬的

學(xué)習(xí)訓(xùn)練[8 ] 。

　　實驗中,我們用52溴222脫氧尿嘧啶核苷(BrdU)

標記增殖細胞。BrdU 是胸腺嘧啶核苷的類似物,當

細胞處于DNA 合成期(即S 期) ,摻入到新合成的

DNA 中,能較好地反映齒狀回細胞的增殖情況。

本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn),未經(jīng)Y迷宮訓(xùn)練的大鼠海馬

齒狀回內(nèi)可見少量的BrdU 陽性細胞,且大多沿顆

粒下層聚集狀分布,提示增殖細胞是由一個神經(jīng)干

細胞/ 前體細胞分裂而來的。學(xué)習(xí)訓(xùn)練可以影響海

馬的神經(jīng)發(fā)生,Morris 水迷宮學(xué)習(xí)可促進海馬齒狀

回神經(jīng)前體細胞增殖及存活[5 ,6 ] 。本實驗結(jié)果顯

示,Y迷宮訓(xùn)練組齒狀回BrdU 陽性細胞數(shù)多于對

照組,其中以顆粒下層增多*明顯?？梢?/span>Y迷宮訓(xùn)

練能增加齒狀回BrdU 陽性細胞數(shù),促進海馬神經(jīng)

干細胞/ 前體細胞的增殖。

海馬新生神經(jīng)元參與了依賴海馬的學(xué)習(xí)記憶形

成。跑步、豐富多彩的環(huán)境[3 ,4 ]能促進海馬神經(jīng)發(fā)生,提高水迷宮實驗的成績;長期應(yīng)激[3 ,4 ]在抑制海

馬神經(jīng)發(fā)生的同時,降低水迷宮實驗成績。這些都

支持海馬神經(jīng)發(fā)生與空間學(xué)習(xí)能力相關(guān)的論點。本

實驗結(jié)果表明:學(xué)習(xí)成績的優(yōu)劣與海馬齒狀回神經(jīng)

發(fā)生存在相關(guān)性,學(xué)習(xí)成績良好組齒狀回BrdU 陽

性細胞多于成績低劣組。Ambrogini 等[9 ]也報道過

類似的結(jié)果,他們發(fā)現(xiàn)Morris 水迷宮學(xué)習(xí)成績與海

馬齒狀回神經(jīng)發(fā)生直接相關(guān),成績良好的大鼠齒狀

回BrdU 陽性細胞多于成績低劣的大鼠。

至于這些新生細胞的分化前景,有待今后進一

步探討。